Linee di ricerca

Il laboratorio di malattie infettive situato presso il polo universitario L. Sacco svolge studi nei settori della genomica, epidemiologia, immunologia e microbiologia delle malattie infettive. Il laboratorio ha una lunga esperienza nella genotipizzazione di HIV e nel monitoraggio della resistenza ai farmaci antiretrovirali. È diviso in due unità strutturalmente e funzionalmente separate ma strettamente interagenti, una destinata alla coltura cellulare, all'isolamento del virus, alla sierologia e alle analisi immunofenotipiche; l'altro assegnato all'amplificazione ed al sequenziamento degli acidi nucleici. Il Laboratorio dispone di avanzate apparecchiature che includono un sistema PCR digitale Droplet QX200 (Bio Rad), una real time PCR Rotor-Gene Q (Qiagen), un sequenziatore automatizzato di DNA a 16 capillari (XL 3130, Thermo Fisher Scientific), un Automated Liquid Handler (Hamilton) e due strumenti di sequenziamento di nuova generazione, MiSeq (Illumina) e Ion S5 System (Thermo Fisher Scientific). L'analisi delle sequenze, le procedure bioinformatiche (Geneious, BIOEDIT, CLUSTALX, pacchetto PHYLIP, SeqSphere, Beast, Beauty ecc.) e i software per la conduzione delle analisi statistiche (pacchetti R, SPSS e SAS) sono supportati da una rete informatica dedicata di 5 PC collegati in local networking da un Hub Server. E’ inoltre dotato di una stanza a pressione positiva (Clean room) per prevenire le contaminazioni in particolare nelle procedure di amplificazione.

I test fenotipici vengono eseguiti all'interno di un'area certificata di livello 3 di biosicurezza dotata di tutti i sistemi dedicati. Sono disponibili numerose linee cellulari reporter ben caratterizzate. Nell’ambito del sistema di sorveglianza nazionale di Salmonella e Listeria il Laboratorio di Malattie Infettive si occupa della caratterizzazione dell’intero genoma.

 

Metodologie utilizzate

Modelli in vitro

linee cellulari (i.e. ACH2, MT-2, OM-10, U1, U1-937, H9, JURKAT, U87.CD4.CXCR4, U87.CD4.CCR5, MDCK, VERO, HL60, EOS-KL60, K5623T3L1), linfotici

Biologia molecolare

- Estrazione di RNA virale da plasma/siero e RNA intracellulare

- Estrazione di DNA genomico da PBMC (cellule mononucleate di sangue periferico), sangue intero e tessuto

 - Estrazione di DNA batterico da colonia

- Frammentazione DNA virale e batterico mediante enzimi di restrizione e sonicazione

- Sintesi ed amplificazione di cDNA mediante RT-PCR

- Amplificazione di DNA con tecniche di PCR, Nested PCR e XL PCR

- Purificazione di DNA amplificato tramite PCR

- Elettroforesi su gel di agarosio

- Elettroforesi su gel di poliacrillamide

- PCR di sequenza tramite metodica dei terminatori marcati

- Sequenziamento automatico in cycle sequencing utilizzando la tecnica dei terminatori marcati con sequenziatore ad elettroforesi capillare ABI PRISM 3130XL

- Next generation sequencing, MiSeq, NextSeq, Illumina; IonS5, ThermoFisher Scientific

- Real-Time PCR

- Determinazione di antigeni virali tramite saggio immuno-enzimatico ELISA

- Clonaggio molecolare tramite vettore plasmidico e trasformazione di cellule competenti di E. Coli

- Preparazione delle librerie di next generation mediante sistema di automazione Microlab STAR Liquid Handling System, Hamilton

- Droplet Digital PCR

- Determinazione del tropismo di HIV-1 tramite saggio tramite cellule U87.CD4.CXCR4, U87.CD4.CCR5 ed interpretazione con algoritmo geno2pheno

- Determinazione della suscettibilità in vitro a farmaci antiretrovirali

 

Principali collaborazioni nazionali e internazionali

• Università di Siena - Prof. Maurizio Zazzi, Dr. Francesco Saladini
• Johns Hopkins University School of Medicine - Dott. Francesco R Simonetti
• Università Campus Biomedico - Prof. Massimo Ciccozzi, Prof. Silvia Angeletti
• Istituto Superiore di Sanità - Dott. Alessandra Lopresti
• Università degli Studi di Milano - Prof. Elisabetta Tanzi, Prof. Antonella Amendola, Prof. Camilla Luzzago, Prof. Stefania Lauzi, Prof. Claudio Bandi, Prof. Jeanette Maier
• Fondazione Invernizzi
• Università degli Studi di Bari - Prof. Gioacchino Angarano, Prof. Laura Monno
• Università degli Studi di Firenze – Prof. Andrea Trabocchi
• Università degli Studi Roma Tor Vergata – Dr.ssa Maria M. Santoro
• IZS Sardegna- Dott. Riccardo Barzagli
• IZS Lombardia ed Emilia Romagna - Dr.Ana Moreno