Laboratorio del Complemento
Linee di ricerca
L’attività di ricerca del nostro laboratorio verte nel campo della biologia molecolare, della biologia cellulare e della biochimica ed è rivolta sia a tematiche di base (meccanismi molecolari della specificità delle proteasi a serina e dei loro inibitori, serpine), sia allo studio dei processi molecolari implicati nella patogenesi di malattie genetiche umane (individuazione di nuovi biomarcatori utili per la medicina di precisione). L’approccio è incentrato sulla caratterizzazione funzionale e strutturale delle proteine implicate nei processi in esame, sia saggiando direttamente i campioni ex-vivo, sia mediante la manipolazione genetica e l’espressione eterologa delle stesse.
In particolare, il laboratorio è focalizzato sullo studio dei meccanismi molecolari alla base di patologie da deficit di inibitori del sistema del complemento. Il principale filone di ricerca coinvolge il deficit di C1-inibitore (C1-INH) in pazienti affetti da angioedema ereditario (C1-INH-HAE), mentre un secondo riguarda il deficit di Fattore H (FH) soprattutto nella sindrome emolitico uremica (SEU).
Nello specifico i progetti portati avanti sono:
1) caratterizzazione di mutazioni del C1-INH e valutazione dell’effetto dominate negativo dell’allele mutato sull’allele wild-type. In pazienti eterozigoti per mutazioni del C1-INH i livelli plasmatici della proteina C1-INH funzionale risultano decisamente inferiori al 50% che dovrebbe essere garantito dall’allele normale. Il meccanismo di down-regolazione dell'allele normale viene studiato a livello pre e post-traduzionale sia in pazienti che in modelli in vitro.
2) studio dell’interazione del C1-INH con l’endotelio. Dato che l’angioedema da carenza di C1- INH è caratterizzato da un aumento della permeabilità vascolare stiamo indagando il meccanismo di legame del C1-INH alle cellule endoteliali in presenza di diversi stimoli. La ricerca si propone soprattutto di elucidare il ruolo del dominio N-terminale altamente glicosilato nell’interazione con l’endotelio, valutando le differenze di legame tra il C1-INH plasmatico e una forma ricombinate differentemente glicosilata.
3) caratterizzazione molecolare di FH e autoanticorpi anti-FH da siero di pazienti affetti da sindrome emolitico uremica (SEU). Il nostro ruolo in questo progetto è quello dell’isolamento della proteina mutata o degli auto-anticorpi e la loro caratterizzazione mediante metodi messi a punto nel nostro laboratorio.
Metodologie utilizzate
Nel nostro laboratorio sono applicate diverse tecniche biochimiche, di biologia molecolare e di biologia cellulare.
Tecniche biochimiche: cinetiche enzimatiche mediante tecniche spettrofotometriche ed elettroforetriche, Western Blot, ELISA, analisi di isoelettrofocusing, cromatografia in fase liquida (FPLC).
Tecniche di Biologia molecolare: clonaggio molecolare, mutagenesi sito-specifica, trasformazione, espressione e purificazione di proteine ricombinanti in cellule procariotiche ed eucariotiche, analisi dell’espressione genica (qPCR)
Tecniche di Biologia cellulare: utilizzo di colture cellulari primarie e linee cellulari (es. HUVEC, EaHy.924, HepG2, HeLa), trasfezione, test di permeabilità, microscopia a immunofluorescenza e confocale, in-cell ELISA.
Principali collaborazioni
• ITACA: network italiano per lo studio della patofisiologia dell’angioedema ereditario (HAE).
• ASST Fatebenefratelli Sacco, Ospedale Luigi Sacco, Milano: per lo studio del HAE.
• IRCCS-Istituti Clinici Scientifici Maugeri, Milano: per lo studio del HAE.
• Pharming Technologies Group NV, Leiden, The Netherlands: per lo studio dell’interazione tra C1-INH ricombinante ed endotelio.
• Medical University of Sofia, Clinical Center of Allergology, University Hospital "Alexandrovska", Sofia, Bulgaria: per lo studio delle mutazioni nel gene SERPING1 associate ad HAE.
• CeMIA SA; Department of Immunology & Histocompatibility, University of Thessaly, School of Health Sciences, Faculty of Medicine, Larissa, Greece: per lo studio genetico dell’angioedema ereditario di origine ignota.
• Princess Haya Biotechnology Center, Jordan University of Science and Technology, Irbid, Jordan: per lo studio dell’angioedema ereditario dovuto a carenza di C1-INH.
• University of Grenoble Alpes, and CNRS, LIPHY, Grenoble, France: per gli studi di microfluidica in ambito HAE
• IRCCS Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico, Milano: per lo studio della sindrome emolitico uremica.
• Serpin Italian Network (SerpIN): per lo studio dei meccanismi di base dell'azione delle serpine e delle patologie ad esse associate.